茶多酚（EGCG)影响乳腺癌组织C-Jun 蛋白表达研究--三分治基础与临床

茶多酚影响乳腺癌组织c-jun 蛋白表达研究
            陈信义张燕明
           北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京：100700）
           北京市/教育部重点研究室（中医内科学），北京：100700）

摘要：目的 观察茶多酚对移植性小鼠乳腺癌（emt6）肿瘤组织中c-jun 原癌基因蛋白表达影响。方法应用小鼠可移植性乳腺癌emt6 细胞系，经培养传代后，以纯系balb/c 小鼠为荷瘤动物进行肿瘤移植，并采用茶多酚灌胃及局部注射两种干预措施，以免疫组化方法检测小鼠乳腺癌组织c-jun 表达。结果与模型对照组比较，茶多酚两种给药途径的肿瘤组织c-jun 阳性表达明显降低（p<0.05）。结论茶多酚可明显抑制原癌基因蛋白 c-jun 表达，这一环节可能是参与抑制肿瘤新生血管重要过程。
关键词：茶多酚(egcg)；小鼠乳腺癌；c-jun；
既往实验表明，茶多酚能抑制 s180 及emt6 小鼠肿瘤生长[1－4]，并认为降低肿瘤组织微血管密度（mdv）[2]、下调肿瘤组织血管内皮生长因子（vegf）阳性表达与上调金属蛋白酶组织抑制因子ⅱ（timp-2）阳性表达是其抗肿瘤机制之一[3]。在此基础上，我们采用免疫组化法检测了茶多酚干预后的emt6 小鼠肿瘤组织c-jun 原癌基因蛋白表达，为阐明茶多酚抑制肿瘤血管生成的作用环节奠定基础。
1 材料
1.1 动物与细胞系：雌性balb/c 小鼠60 只，体重(20±2)g，购自上海斯克莱实验动物有限公司[许可证号：scxk(沪)2003-0003]，并在南京中医药大学动物中心屏障系统spf 环境下饲养。emt6 小鼠乳腺癌细胞购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心。
1.2 药物：茶多酚(egcg)购自浙江东方茶业有限公司，纯度98％（批号20050334）；人参皂苷rg3（参一胶囊）每粒含人参皂苷rg3 10 mg，购自吉林亚泰有限公司（批号：20040704）。
1.3 仪器：超净工作台系苏州安泰空气技术有限公司生产（型号sa-cjzfd）；离心机由上海安亭科学仪器厂生产（型号ka-1000）；莱卡倒置显微镜为德国莱卡公司产品（型号 dmil）；forma 恒温培养箱为美国forma 公司产品（型号3111）。
1.4 试剂：c-jun oncoprotein 抗体由美国castratm 公司提供（批号:105205）；免疫组化超敏鼠组织试剂盒（ultrasensitivetms-p）购自福州迈新生物技术开发有限公司。
2 方法
2.1 细胞培养与接种：emt6 细胞用含10％小牛血清的rmpi1640 培养液培养，细胞长满单层后用0.25％胰酶消化，培养液吹打离心，收集细胞用pbs 稀释，浓度调至5×106，每只小鼠以0.2 ml 接种于小鼠右后背部。12 天后肿瘤长至1g 时移植。2.2 肿瘤移植：断颈处死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3～5min 后放于超净工作台平皿中，用高压灭菌的手术器械剪开肿瘤皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤以消毒后的pbs 清洗，称重，按每克肿瘤4ml 溶液的比例用生理盐水稀释。剪碎瘤体，充分匀浆制成细胞悬液，浓度调至2×106，每只小鼠于右后背部皮下接种0.2ml。2.3 分组及用药：接种第13 天肿瘤长至1mm3 时（成瘤48 只），随机分为4 组，即茶多酚灌胃组、茶多酚局部注射组、人参皂苷rg3 灌胃组，模型对照组。每组12 只动物。所有给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。即：①茶多酚灌胃组：按人治疗量900mg/d 计算，换算成实验用药中剂量为11.25mg/kg，并按小鼠体重20g 计算，以2.25mg/d 配置浓度
5.625mg/ml，每天灌胃0.4ml。②茶多酚局部注射组：参考茶多酚腹腔注射ld50 160mg/kg剂量，取其1/4 量为实验用小剂量组，换算成实验用药中剂量为12mg/kg，以2.4mg/d 配制浓度24mg/ml，每天局部注射0.1ml。③人参皂苷rg3 组：按人*剂量40mg/d 计算，换算成20g 小鼠剂量为0.1mg/d，配制浓度为0.25mg/ml，每天灌胃0.4ml。④模型对照组：生理盐水灌胃，每天0.4ml。在接种第13 天开始给药、给水，每日1 次，连续给药10 天。第11 天处死小鼠，取肿瘤组织制备切片待捡。
2.4 原癌基因蛋白c-jun 检测：将肿瘤组织取出后迅速放置于10%福尔马林溶液中固定，第二天脱水，石蜡包埋，连续切片为4um 厚，其中取一张做he 染色，其余每组选取3 个组织切片，按相关试剂盒说明检测c-jun 表达。用pbs 作为一抗做阴性对照。各组选取肿瘤组织3 个组织切片，每片选3 个视野，用美国tn-8502 图像分析系统作图像分析，测定光密度（iod）值，取其平均值，以均数±标准差（x ± s）表示。
2.5 统计方法：实验数据用spss11.5 计算机统计软件进行t 检验，当p<0.05 时表示差异有显著性，当p>0.05 时表示无统计意义。
3 结果
按照试剂合说明书进行emt6 肿瘤组织c-jun 检测，图像分析数据见下表；组化染色结果显示，模型对照组、人参皂苷组的c-jun 阳性表达明显增强，而茶多酚两种给药途径均能够有效的降低c-jun 阳性表达，结果见图1－4。
                   肿瘤组织c-jun测定的iod值( x ± s )
分组                                       c-jun
人参皂苷组                              125.64±14.25
茶多酚灌胃                              108.42±25.17*
茶多酚注射                              101.70±28.76*
模型对照组                              134.40±28.88
与模型对照组、人参皂苷比较：﹡p<0.05
从上表可以看出，与模型对照组比较，经茶多酚干预后的emt6 小鼠肿瘤组织的c-jun表达明显减少。说明茶多酚能够下调原癌基因c-jun 蛋白表达。

图 1.模型组肿瘤组织c-jun 表达（×200）

图 2.茶多酚(egcg)灌胃组肿瘤组织c-jun 表达（×200）

图 3.茶多酚(egcg)局部注射组肿瘤组织c-jun 表达（×200）

图 4.rg3 组肿瘤组织c-jun 表达（×200）

4 讨论
   c-jun 是原癌基因c-jun 表达产物，该基因蛋白Zui初是从鸡肉瘤病毒17（asv17）中发现，其是转录激活蛋白-1（ap-1）的重要组成成分之一。ap-1 是由c-jun 和c-fos 通过亮氨酸拉链结构连接而组成的异源二聚体，为一类介导生长刺激信号的转录因子。因此，c-jun在ap-1 中占有中药位置。有研究证明，在无c-fos 的情况下，c-jun 可形成同源二聚体，继续发挥其转录因子作用；相对而言，c-fos 则无此功能效应。c-jun 基因蛋白表达下降会直接影响ap-1 活性[5-7]。

    c-jun 基因蛋白与新生血管生成关系极为密切。vegf 基因启动子中含有4 个ap-1 的结合位点。在低氧或缺氧情况下可使vegf 合成增加。ryuto 等研究发现，脑胶质细胞vegfmrna 表达水平与c-jun 和c-fosmrna 呈正相关，在低氧刺激下可迅速使胶质细胞c-fosmrna 升高，持续3h 后c-jun 和vegf 表达亦随之上调。凝胶移动检测（gel shift assay）显示，低氧刺激1-3h 后，ap-1 与vegf 启动子佛波酯应答元件（tpa response

element,tre）结合明显增强。这一现象在肝癌细胞中也得到了证明[8]。damert 等为研究低氧情况诱导vegf 转录机制，利用虫荧光素酶报告基因结构方法，对胶质细胞瘤c6 细胞的vegf 启动子进行定位后发现，胶织瘤细胞内仅保留低氧反应区（hypoxia-inducible factor 1,hif1），而剔除上游ap-1 结合序列，低氧能够使vegf 表达水平降低。当重新导入ap-1 结合位点后，vegf 表达则明显上调。提示ap-1 是vegf 转录所必需物质基础[9]。另外，vegf 与其受体kdr 结合后通过有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase,mapk）途径发挥作用也需要ap-1。有文献资料证明，在以内皮细胞增殖为基础的新生血管形成连锁反应过程中，需要多个基因或信号传导系统如sos、ras、raf、mapkk 共同参与下才能完成 [10]

    在金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, mmps）基因启动子过程中至少含有1 个ap-1结合位点。mmp-9 含有2 个ap-1 结合序列，位于-72~-66 之间的ap-1 结合位点对于mmp表达至关重要。如果该位点突变则mmps 启动子对外界的刺激反应会大大降低[11]。因此，以ap-1 为靶点的基因治疗可明显抑制mmps 转录，下调mmps 蛋白表达。
我们的实验结果显示，茶多酚能够下调多种移植性小鼠肿瘤mvd、vegf 表达，上调timp-2 表达[1-4]。该实验进一步说明，茶多酚抑制emt6 乳腺癌新生血管生成的作用机制可能与其下调c-jun 表达，降低ap-1 与dna 结合的活性，减少mmps 生成有关。通过该实验结果推测，茶多酚不仅从转录水平减少了vegf 合成，而且还可通过阻断vegf 信号通路途径，来抑制vegf 介导的肿瘤新生血管生成。有关茶多酚（egcg)抗肿瘤新生血管生成其他作用途径我们将正在后续的研究中陆续报道。
参考文献
1 徐力，侯丽，刘杰，等.茶多酚对移植性s180小鼠肿瘤模型抑瘤率的影响[j].中华中医药杂志，2005，20
（12）：718-720
2 万明月，叶霈智，徐力，等.茶多酚对移植性小鼠肿瘤微血管密度影响研究[j].中医药学刊，2005，23
（12）：2162-2164
3 徐力，李冬云，侯丽，等.茶多酚干预移植性s180小鼠肿瘤血管相关因子表达[j].中国肿瘤，2006，（06）：
363-365
4 张燕明，徐力，陈信义.茶多酚抗移植性乳腺癌作用的研究[j].国际中医中药杂志，2006，28（6）：354-356
5 peter k vogt. jun, the oncoprotein [j]. oncogene, 2001, 20(19):2365-2377
6 jochum w， passegue e， wagner e f. ap-1 in mouse development and tumorigenesis. oncogene，2001；
20:2401-2412
7 shaulian e，karin m. ap-1 in cell proliferation and survival. oncogene，2001；20:2390-2400
8 ryuto m，ono m，izumi h，et al. induction of vascular endothelial growth factor by tumor necrosis factor alpha
in human glioma cells. possible roles of sp-1.j biol chem，1996；271 （45）:28220-28228
9 damert a ， ikeda e ， risau w. activator-protein-1 binding potentiates the hypoxia-inducible
factor-l-mediated hypoxia-induced transcriptional activation of vascular endothelial growth factor expression in
c6 glioma cells. biochem j，1997；327:419-423
10 寿成超.血管内皮细胞的增殖调节与抗血管肿瘤生物治疗.中国肿瘤生物治疗杂志，1999； 6（3）:175-176
11 westermarck j， kahari vm. regulation of matrix matalloproteinase expression in tumor invasion. faseb， 1999；
13:781-789

effct of tea polyphenols on expression of c-jun in breast cancer
chen xin-yi，zhang yan-ming*，xu li，neoplastic hematology department of dongzhimen hospital，beijing
university of traditional chinese medicine， beijing 100700，
abstract
object observe the effect of tea polyphenols on expression of c-jun in transplantation breast
mice.methods mammary adenocarcinoma emt6 was cultured and propagated, then implanted on
female balb/c mice. tea polyphenols was peroral administrated and local injected, c-jun in
tumor tissue was detected by immunohistochemical method. result oral administration and local
injection of tea polyphenols on implanted breast cancer mice could markedly reduce expression of
c-jun in tumor tissue(p<0.05).conclusion:tea polyphenols could inhibit the expression of c-jun,
which may join the course of tumor angiogenesis.
key words: tea polyphenols; breast caner; c-jun
[作者简介] 陈信义，男，52 岁，教授，博士生导师；

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(编号：30472280)
[实验场地] 北京市重点实验室（中医内科学）