茶多酚(EGCG)联合恩度对人肺腺癌A549抑制作用研究---三分治基础与临床探

茶多酚(egcg)联合恩度对人肺腺癌a549抑制作用研究---三分治基础与临床探索

   茶多酚（egcg)联合恩度对人肺腺癌a549抑制作用研究 
              马成杰1，2，李元青1，2，刘朝阳3，陈信义1，2   
          1北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京（100700） 

          2教育部、北京市重点实验室（中医内科学），北京（100700） 
          3中国医学科学院肿瘤研究所，北京（100021） 
 
摘  要：目的：观察茶多酚联合恩度（重组人血管内皮抑制素）对人肺腺癌生长抑制作用，为进一步深入研究茶多酚抗肿瘤血管生成机制提供依据。方法：人源肺腺癌（a549）细胞系经传代培养后，移植于balb/c-nu祼鼠，以茶多酚、恩度及其联合用药干预治疗，通过观察肿瘤抑制率评价单用与联合用药对a549生长抑制作用。结果：茶多酚、恩度以及茶多酚联合不同剂量恩度的肿瘤抑制率分别为40.2%、35.8%、41.9%和44.2％，与模型组比较，具有统计学意义（p＜0.01）；治疗各组间比较，无统计学意义（p＞0.05)。结论：茶多酚、恩度及其联合用药对a549均有明显的抑制效果；茶多酚与恩度联合使用增效作用不明显。 

关键词：茶多酚，恩度（重组人血管内皮抑制素)，人肺腺癌（a549) 
 
恩度(endostar)是国内首例重组人血管内皮抑制素，它是通过抑制血管内皮细胞迁移来抑制肿瘤新生血管形成。恩度联合np（长春瑞滨加顺铂）化疗方案治疗初治或复治的/ⅲⅳ期非小细胞肺癌有一定疗效。近年来研究证明，茶多酚对肿瘤血管生成有明显的抑制效果，其作用机制是调控血管生成因子表达[1-6]。为探讨重组人血管内皮抑制素与茶多酚联合应用抗肿瘤效应，并深入研究茶多酚抗肿瘤新生血管生成机制，我们在既往研究基础上，复制了移植性人肺腺癌（a549）肿瘤动物模型，观察了单用茶多酚、恩度以及茶多酚联合恩度对a549肿瘤抑制率，探讨联合用药的增效作用。

1 材料 
1.1 动物与细胞系 
balb/c-nu裸鼠40只，6～8周龄，spf级，雌雄各半，由中国医学科学院肿瘤研究所实验动物室繁育并提供，生产合格证号：京动许字（1999）第015号；动物合格证号：scxk京2004－0006，在动物实验中心屏蔽系统辅以洁净层流柜环境中饲养。人肺腺癌（a549）细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所检测中心常规保存并提供。 
1.2 药物 
茶多酚(egcg)系江西绿康天然产物有限责任公司惠赠，纯度98%；恩度由烟台麦得津生物工程股份有限公司惠赠（生产批号20060903）。 
1.3 仪器 
超净工作台系苏州宏瑞净化科技有限公司生产(型号：scw-cj)；实验用离心机系江苏恒瑞制药机械有限公司生产(型号：ls150)；倒置显微镜系日本nikon株式会社生产 (型号：ts100)；游标卡尺系中国杭州工具量具有限公司生产(型号：hgl-18-1)；奥豪斯电子精密天平系美国ohaus公司产品（型号：ara520）；forma恒温培养箱为美国forma公司产品（型号：3111）。

                                                        
本课题得到国家自然科学基金（编号：30472280）的资助。

2 方法 
2.1 细胞培养与接种 
人肺腺癌a549在含有10%小牛血清的dmem培养液培养，细胞长满单层后用0.25%胰蛋白酶消化，培养液吹打、离心，收集细胞用pbs稀释，调细胞浓度至1×107个细胞/ml，每只小鼠以0.2ml接种于右腋皮下，肿瘤长至体积约为1000mm3时移植。 
2.2 造模及分组 
选择生长状态良好、肿瘤无破溃的荷瘤裸鼠，断颈处死，在净化工作台内，无菌条件下完整剥离瘤结，用生理盐水洗去血渍，剪开瘤结，清除中心坏死组织，充分匀浆制成肿瘤细胞悬液，并加生理盐水稀释细胞数至1×107/ml。取细胞悬液0.2ml，在30分钟内分别接种于裸鼠右腋窝皮下。10天后肿瘤体积约在100-300mm3之间（40只裸鼠造模全部成功）时，按性别、肿瘤体积大小随机分模型对照、茶多酚，恩度、茶多酚加恩度组与茶多酚加1/2剂量恩度5组，每组8只，称重标号。 
2.3 给药剂量与方法 
给药剂量与方法如下：①肿瘤模型对照组，生理盐水每天0.2ml/10g腹腔注射；②茶多酚干预组，茶多酚按20mg/kg/d（生理盐水配制成1mg/ml）给药，每天0.2ml/10g腹腔注射；③恩度干预组，恩度按3mg/kg/d（生理盐水稀释成0.15mg/ml）给药，每天0.2ml/10g腹腔注射；④茶多酚加恩度组，茶多酚按20mg/kg/d（浓度为2mg/ml）给药，恩度按3mg/kg/d（浓度为0.3mg/ml）给药，每天各0.1ml/10g腹腔注射；⑤茶多酚加1/2剂量恩度组，茶多酚给药同④，恩度按1.5mg/kg/d（浓度为0.15mg/ml）给药，每天0.1ml/10g腹腔注射。分组当天开始给药，每天1次，连续14天。 
2.4 计算方法 
药物处理前、后每4天用毫米游标卡尺测量肿瘤长、宽Zui大垂直直径。按如下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=肿瘤长径×肿瘤短径2/2。用药结束后2天处死裸鼠，取出肿瘤，称重。按如下公式计算肿瘤抑制率：抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×。 
2.5 统计方法 

采用spss13.0统计软件进行数据处理。干预治疗前后小鼠体重以及肿瘤体积以sx±表示，并采用t检验，组间比较采用f检验，当p<0.05时被认为有统计学意义；肿瘤抑制率以百分率表示。 
3 结果 
3.1一般性观察 
实验前各组裸鼠一般状态良好；实验结束时40只动物全部存活。动态观察发现，模型对照组裸鼠活动减少，反应迟钝；四个治疗组祼鼠觅食、饮水、活动等状况良好，未发现腹泻、淤血等现象。

3.2肿瘤体积变化 
        从分组用药开始到实验结束，移植瘤体积变化见表1 
                      表1.实验各组肿瘤体积动态变化（sx±) 
                                        肿瘤体积mm3

时间               模型对照组                  茶多酚干预组                 恩度干预组              

第0天             173.37±30.88         158.95±32.50               166.69±38.70             

第4天             371.67±45.46         265.13±47.00*             267.31±61.34*          
第8天             739.52±127.85        400.74±102.20*           410.76±75.17*            

第12天           1187.95±212.28      780.28±183.10*           801.22±133.62*           

第16天           1874.69±564.99       1158.43±263.01*        1246.51±221.75*  

 时间               多酚加恩度组                   茶多酚加1/2恩度组

第0天               164.68±36.55              173.45±50.48 

第4天               273.82±49.59              264.12±35.42*
第8天               382.16±59.86*            430.30±96.12*

第12天              713.30±129.84*          766.66±168.77* 

第16天             1143.68±212.28*         1199.65±290.82* 

与模型组比较，*p＜0.01 
从表1可以看出，从用药后第4天开始，四个*体积均小于模型组，有统计学意义（p＜0.01），但四组之间无统计学差异（p＞0.05）；这一趋势从第4天开始，直致第16天实验结束。说明茶多酚、恩度干预对人肺腺癌移植瘤抑制作用稳定，疗效相近，两药联合使用增效作用不明显。 
3.3 肿瘤抑制率 
实验结果可见(表2)，茶多酚、易瑞沙及两个联合用药组抑瘤率相近，与模型组比均有统计学意义（p＜0.01）；联合用药与单用药相比，抑瘤率未见明显增加，无统计学差异（p＞0.05）。 
                        表2.实验各组肿瘤重量与抑瘤率（sx±） 
分  组                          n                      瘤 重(g)                         抑瘤率(%) 
模型对照组                   8                     1.70±0.59                        — 

茶多酚干预治疗组           8                     1.02±0.31*                     40.2 

恩度干预治疗组              8                     1.09±0.34*                     35.8 

茶多酚加恩度组             8                     0.99±0.37*                      41.9 

茶多酚加1/2剂量恩度组   8                     0.95±0.30*                      44.2 
与模型组比较，*p＜0.01

4 讨论 
茶多酚是茶叶（特别是绿茶）中的主要成分，约占茶叶干重的 30% 左右。研究证实，茶多酚可通过多种途径对肿瘤形成产生影响，包括抑制肿瘤细胞生长、抗突变、诱导肿瘤细胞凋亡与分化等。自cao等[1]报道饮茶以及绿茶提取物有抗新生血管形成的作用以来，茶多酚抗肿瘤血管生成研究逐渐被重视起来。jung等[2]的研究表明，茶多酚的主要成份表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)通过抑制结肠癌细胞血管内皮生长因子（vegf）的表达，降低肿瘤微血管密度，抑制肿瘤生长。我们把茶多酚对肿瘤血管生成的抑制作用作为重点，进行了系列研究。前期的研究证明，茶多酚对移植性s180及乳腺癌emt6小鼠肿瘤均有明显抑制作用[4、5]
；检测肿瘤组织mvd、timp-2、vegf发现，茶多酚可以通过下调vegf、上调timp-2的表达，抑制肿瘤微血管的生成，降低肿瘤微血管密度[6]。说明抑制血管生成是茶多酚抗肿瘤的主要机制之一。 
非小细胞肺癌（nsclc）属常见高发肿瘤，对放化疗敏感性差，但其瘤体血管丰富，抑制其血管生成疗效显著，是目前抗肿瘤血管生成研究的重点。血管内皮抑素(endostatin)就是抑制nsclc血管生成研究比较成功的药物之一。endostatinZui初是从鼠的成血管细胞瘤株培养液中分离提纯得到的一种内源性糖蛋白，它与细胞外基质胶原ⅹⅷ的羧基末端具有同源性,具有抗血管生成作用[7]。近来的研究表明，endostatin通过特异性地作用于新生血管的内皮细胞并抑制内皮细胞迁移，同时诱导其凋亡，从而发挥抗血管生成作用；另外，还通过调节肿瘤细胞表面vegf的表达及蛋白水解酶的活性，多靶点发挥抗血管生成作用，间接导致肿瘤休眠或退缩[8、9]。我们实验所使用的恩度是是烟台麦得津生物工程股份有限公司采用大肠杆菌作为表达体系生产出了新型重组人血管内皮抑制素(yh216)，ⅰ、ⅱ、ⅲ临床试验都表明人体耐受性良好。单用有一定的抗肿瘤效果，联合长春瑞滨和顺铂(np方案)对非小细胞肺癌有较好的疗效[10-12]。因此建立人肺腺癌a549移植瘤裸鼠模型，选择恩度作为对照