茶多酚（egcg)对乳腺癌组织及重要器官微血管密度影响研究
              张燕明1 陈信义1 徐力2
             北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科（100700）

摘要：目的观察茶多酚对小鼠乳腺癌组织及重要脏器（心、脑、肾）组织中微血管密度（mvd）表达影响，用以判定茶多酚抗肿瘤新生血管形成特异性。方法应用小鼠可移植性乳腺癌emt6 细胞株，经培养传代后，以纯系balb/c 小鼠为荷瘤动物，并以茶多酚灌胃及局部注射两种干预方法，以免疫组化法检测小鼠乳腺癌组织和重要脏器（心、脑、肾）组织微血管密度（mvd）。结果茶多酚灌胃组、局部注射组肿瘤组织mvd 较模型组明显减少（p<0.05）；心、脑、肾组织mvd 在茶多酚灌胃组、局部注射组与模型组比较无明显差异（p>0.05）。结论茶多酚可选择性的抑制乳腺癌组织微血管生成，对重要脏器（心、脑、肾）组织无显著的影响。
关键词：茶多酚；小鼠乳腺癌；微血管密度（mvd）；脏器组织
    关于茶多酚抗肿瘤血管生成的研究，近年来已有相关报道，证明绿茶提取物或egcg 等可以抑制肿瘤细胞分泌vegf，抑制肿瘤血管生成[1～7]。我们在观察茶多酚抑制s180 小鼠移植性肿瘤生长及对新生血管抑制效应基础上，进行了茶多酚对小鼠乳腺癌（emt6）抑制生长效应研究，并在观察茶多酚对肿瘤微血管密度影响同时，考察其对心、脑、肾重要脏器微血管密度影响，以判定茶多酚抗新生血管形成的特异性，并用以指导新药研发，并为临床应用提供依据。
1 实验材料
1.1 动物与细胞系
    雌性balb/c 小鼠60 只，体重(20±2)g，购自上海斯克莱实验动物有限公司[许可证号：scxk(沪)2003-0003]，在南京中医药大学动物中心屏障系统spf 环境下饲养。emt6 小鼠乳腺癌细胞系购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心。
1.2 实验药物
    茶多酚购自浙江东方茶业有限公司，纯度98％（批号：20050334）；对照药：人参皂苷rg3（参一胶囊）每粒含人参皂苷rg3 10 mg，购自吉林亚泰有限公司（批号：20040704）。
1.3 实验仪器
    超净工作台系苏州安泰空气技术有限公司生产（型号sa-cj-zfd）；离心机由上海安亭科学仪器厂生产（型号ka-1000）；莱卡倒置显微镜为德国莱卡公司产品（型号 dmil）；forma恒温培养箱为美国forma 公司产品（型号3111）。
1.4 试剂：

     八因子相关抗原（ⅷ-rag）多克隆抗体系由美国dako 公司生产（批号：a 0082）、免疫组化超敏鼠组织试剂盒（ultrasensitivetms-p）购于福州迈新生物技术开发有限公司。
2 实验方法
2.1 细胞培养与接种
    emt6 细胞用含10％ 小牛血清的rmpi 1640 培养液培养，细胞长满单层后用0.25％胰酶消化，培养液吹打离心，收集细胞用pbs 稀释，浓度调至5×106，每只小鼠以0.2 ml 接种于小鼠右后背部。12 d 后肿瘤长至1 g 时移植。
2.2 肿瘤移植：

     断颈处死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3～5min 后放于超净工作台平皿中，用高压灭菌的手术器械剪开肿瘤皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤以消毒后的pbs 清洗，称重，按每克肿瘤4 ml 溶液的比例用生理盐水稀释。剪碎瘤体，充分匀浆制成细胞悬液，浓度调至2×106，每只小鼠于右后背部皮下接种0.2 ml。
2.3 分组及用药
     接种第13 天肿瘤长至1 mm3 时（成瘤48 只），随机分为4 组，即茶多酚灌胃组、茶多酚局部注射组、对照药人参皂苷rg3 灌胃组，模型对照组。每组12 只动物。所有给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。即：①茶多酚灌胃组：按人治疗量900 mg/d 计算，换算成实验用药中剂量为11.25 mg/kg，并按小鼠体重20 g 计算，以2.25 mg/d 配置浓度5.625mg/ml，每天灌胃0.4 ml。②茶多酚局部注射组：参考茶多酚腹腔注射ld50 160 mg/kg 剂量，取其1/4 量为实验用小剂量组，换算成实验用药中剂量为12 mg/kg，以2.4 mg/d 配制浓度
24 mg/ml，每天局部注射0.1 ml。③人参皂苷rg3 组：按人*剂量40 mg/d 计算，换算成20 g 小鼠剂量为0.1 mg/d，配制浓度为0.25 mg/ml，每天灌胃0.4 ml。④模型对照组：生理盐水灌胃，每天0.4 ml。以上各组连续给药10 天。第11 天处死小鼠，取肿瘤组织以及心、脑、肾组织检测mvd。
2.4 mvd 表达的检测
将肿瘤组织及心、脑、肾组织取出后迅速放置于10%福尔马林溶液中固定，第二天脱水，石蜡包埋，连续切片为4um 厚，取其中一张做he 染色，其余每组选取3 个组织切片，按相关试剂盒说明检测mvd 的表达，用pbs 作为一抗阴性对照。阳性染色为棕黄色，部位在内皮细胞胞浆。将染色的切片以美国tn-8502 图像分析系统处理，测定光密度（iod）值，取三张组织切片测定的平均值，并以均数±标准差( x ± s )表示。
2.5 统计方法：

实验数据用spss11.5 计算机统计软件进行处理，t 检验统计处理，当p<0.05
时表示差异有显著性，当p>0.05 时表示无统计意义。
3 结果
3.1 肿瘤组织mvd 的测定
     乳腺癌组织微血管密度影响测定结果表1，图1-图4。
           表1、小鼠乳腺癌组织微血管密度影响测定结果
分组                                          iod值（x ± s）
模型对照组                                     151.69±15.58
rg3 对照组                                     141.76±14.38
灌胃实验组                                     109.54±20.30*
局部注射组                                     114.56±37.43△
与模型对照组比较，﹡p<0.01；△p<0.05
上表结果显示，茶多酚灌胃组及局部注射组肿瘤组织微血管密度与模型组比较，有统计学意义（p<0.01，0.05）；rg3 组与对照组比较，无统计学意义（p>0.05）。表明抑制微血管形成可能是茶多酚抑制乳腺癌生长作用机制之一。
3.2 重要脏器组织mvd 的测定
重要脏器（心、脑、肾）组织微血管密度测定结果表2，图5-图10。
       表 2、重要脏器组织微血管密度测定结果（iod 值，x ± s）
分组                   心脏组织mvd                  脑组织mvd                  肾脏组织mvd
模型对照组       142.89±14.24              134.77±23.63               157.19±10.43
茶多酚灌胃组    130.40±23.52              140.25±22.461              147.51±11.74
从表 2 可以看出，以茶多酚干预后对小鼠心、脑、肾组织微血管密度检测与对照组比较，无统计学意义（p>0.05）。说明经茶多酚干预后对小鼠重要脏器（心、脑、肾）组织器官的mvd 无明显的影响，可以说明茶多酚对新生血管抑制具有一定选择性。
4 讨论
用免疫组化法检测肿瘤微血管密度能够反映肿瘤新生血管增生情况，肿瘤微血管旺盛与肿瘤侵袭、转移以及预后有密切相关。肿瘤细胞增殖需依靠新生血管为其提供血液供应，肿瘤微血管密度越大，肿瘤生长越快[8～9]。因此，在移植性肿瘤动物实验中检测mvd 可以直观地评价肿瘤微血管的生长情况和肿瘤的抑制效应关系。第八因子相关抗原主要表达于血管内皮细胞，其特异性强，能够与内皮细胞，骨髓巨核细胞以及起源于内皮细胞的肿瘤组织结合，而不与其他间质性或上皮组织肿瘤起反应。故用第八因子相关抗原测定肿瘤微血管密度具有良好可重复性。而且，利用肿瘤或脏器组织切片染色背景干扰小，微血管显示清晰[10]。bosari 等对187 例乳腺癌患者进行了长达9 年的随访研究发现，微血管密度与乳腺癌预后密不可分，而且为一独立预后因素。weinder 等也发现，乳腺癌组织的微血管密度与腋淋巴结转移或远处转移有明显的相关性[11-12]。我们的实验结果表明，在成功建立乳腺癌动物模型后，与对照组相比，以茶多酚灌胃与局部注射干预后可见肿瘤生长受抑，受抑机制与抑制肿瘤新生血管形成有关。从临床角度考虑，血管抑制剂分成两类，第一类是特异性或半特异性血管生成抑制剂，其主要抑制ec 增殖和/或迁徙，而对非血管内皮细胞无实质性作用；第二类是非特异性血管生成抑制剂，其靶向作用不明，没有高度选择性，对ec、肿瘤细胞和正常组织细胞都有普遍作用。从传统以杀灭所有癌细胞为宗旨的肿瘤治疗原则来讲，第二类非特异性血管生成抑制剂似乎有一定的优越性，既抑制肿瘤血供又对肿瘤细胞具有细胞毒作用，然而，正是因为这类药物可影响多种细胞，在抑制血管生成的同时会产生多种预计性不良反应，例如，在抑制肿瘤新生血管的同时，对正常组织（重要脏器）细胞的损害作用将会造成机体伤害，或机能上的病理改变带来新的疾病，从而限制了第二类非特异性血管生成抑制剂在临床上的长期应用。
基于以上考虑，为判定茶多酚抗新生血管特异性，我们在检测移植性肿瘤组织微血管密度的同时，以移植性乳腺癌小鼠重要脏器（心、肝、肾）为把器官，检测了组织切片微血管密度。实验结果显示，与模型组对照比较，两组mvd 无统计学意义（p>0.05）。可以推测，茶多酚对肿瘤组织微血管具有一定的选择性，而对正常脏器组织微血管无明显影响，其机制可能是通过对血管相关因子的调节而影响微血管的生成。其主要限于在增生活跃的肿瘤组织微血管形成阶段。而对于已经定型的正常组织器官微血管因其血管生成机制处于关闭状态，因而影响不大，临床使用时不会构成对正常组织器官的功能影响。但是，在以下生理或病理状态还应十分重视，例如在妊娠、发育、创伤后血管再生等生理状态以及脑梗塞缺血、心肌梗塞后的微血管重建等，这些生理或病理状态下应用茶多酚是否会有副面效应，目前尚无相关资料证实，有待进一步深入研究。

图1.模型组肿瘤组织mvd（×200）

图 2.茶多酚灌胃组肿瘤组织mvd（×200）

图 3.茶多酚局部注射组肿瘤组织mvd（×200）

图 4.rg3 组肿瘤组织mvd（×200）

图 5.模型组心脏组织mvd（×200）

图6.茶多酚灌胃组心脏组织mvd（×200）

图7.模型组脑组织mvd（×200）

图8.茶多酚灌胃组脑组织mvd（×200）

图 9.模型组肾脏组织mvd（×200）

图10.茶多酚灌胃组肾脏组织mvd（×200）

observation on express of microvessle density in tumor tissue and vital organs
tissue of tea polyphenols on implanted breast cancer
zhang yan-ming*，xu li，chen xin-yi
neoplastic hematology department of dongzhimen hospital，beijing university of traditional
chinese medicine， beijing 100700，china
abstract
objective to observe the effect of microvessel density expressed in tumor tissue and vital
organs(such as heart,brain,keney) on implanted mouse breast cancer treated by tea polyphynols,
then judge the spencificity of its inhibiting angiogenesis effect. methods mammary
adenocarcinoma emt6 was cultured and propagated, then implanted on female balb/c mice. tea
polyphenols was peroral administrated and local injected, microvessel density in tumor tusuue and
vital organs(heart, brain,keney) was detected by immunohistochemical method. result the
express of microvessel density in tumor tissue of local injection group and peroral administrated
group decreased compared with model group(p<0.05), while the express of microvessel density
in heart, brain and kidney in treated group is of no significant difference compared with model
group(p>0.05). conclusion tea polypynols can selectively inhibit the information of
microvessel of breast cancer in tumor tissue and have no significant effect on vital organs such as
heart, brain and kidney.
【key words】tea polyphenols breast cancer（emt6） microvessel density（mvd）
vital organs
[作者简介] 张燕明，女，30 岁。北京中中医药大学2004 级博士研究生。主要研究领域：中西医结合治疗恶性肿瘤应用基础研究。
[通讯作者] 陈信义，男，52 岁，教授，博士生导师

emil:dzmyyxyk@sohu.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(编号：30472280)
[实验场地] 北京市重点实验室（中医内科学）
参考文献
01 cao y., cao r. （1999）angiogenesis inhibited by drinking tea. nature (lond.)，398:381.
02 jung