三分治基础与临床探索---EGCG联合易瑞沙抗移植性人肺腺癌效应研究

用食用酒精为溶剂提纯的98%egcg

茶多酚（egcg)联合易瑞沙抗移植性人肺腺癌效应研究1
               马成杰 1，2 ，李元青1，2 ，刘朝阳3，陈信义1，2
              1 北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京（100700）
              2 教育部、北京市重点实验室（中医内科学），北京（100700）
              3 中国医学科学院肿瘤研究所，北京（100021）

摘要：目的：观察茶多酚联合易瑞沙（表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制剂）对人肺腺癌生长抑制作用，为进一步深入研究茶多酚抗肿瘤血管生成机制提供依据。方法：人源可移植性肺腺癌（a549）细胞系经传代培养后，以balb/c-nu 祼鼠进行肿瘤移植，并以茶多酚, 易瑞沙及其联合用药进行干预性治疗，通过观察抑瘤率评价单用及联合用药对a549 移植瘤生长抑制作用。

结果：茶多酚、易瑞沙及联合用药的抑瘤率分别为33%、34.1%和57.1％，与模型组相比有统计学意义(p＜0.01)；联合用药与单用药比较，具有统计学意义(p＜0.05)。结论：茶多酚、表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制剂对a549 生长都有明显的抑制效果；两者联合使用抑瘤效果更好。
关键词：茶多酚，易瑞沙（表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制剂），人肺腺（a549）

     非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, nsclc）是临床Zui常见的恶性肿瘤，大多数患者在临床诊断时已属于晚期，失去手术治疗机会[1]，而含铂类药物联合化疗方案失败后则缺乏有效的治疗方法。因此寻找有效的治疗方法已成为nsclc 研究的热点。易瑞沙为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，用于nsclc 治疗，疗效确切[2]。茶多酚是研究较为深入的天然药物，新近研究表明[3、4、5]，茶多酚对nsclc 生长也具有良好的抑制作用。我们推测两药联合使用，可能会提高nsclc 临床疗效，为此我们进行了本次研究。

1 材料
1.1 动物与细胞系
       balb/c-nu裸鼠32只，6～8周龄，spf级，雌雄各半，由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤医院实验动物室繁育并提供。动物生产合格证号：京动许字（1999）第015号；动物合格证号: scxk京2004－0006，在动物实验中心屏蔽系统辅以洁净层流柜环境中饲养。人肺腺癌（a549）细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所检测中心常规保存并提供。
1.2 药物
    茶多酚系江西绿康天然产物有限责任公司惠赠，纯度98%；易瑞沙为astrazeneca公司生产，进口药品注册证号：h20040767，产品批号：228185。
1.3 仪器
       超净工作台系苏州宏瑞净化科技有限公司生产(型号scw-cj)；实验用离心机系江苏恒瑞制药机械有限公司生产(型号ls150)；倒置显微镜系日本nikon 株式会社生产(型号ts100)；游标卡尺系中国杭州工具量具有限公司生产(型号hgl-18-1)；奥豪斯电子精密天平系美国ohaus 公司产品（型号ara520）；forma 恒温培养箱为美国forma 公司产品（型号3111）。

1本课题得到国家自然科学基金（编号：30472280）的资助。

                                        （1） 

2. 方法
2.1 细胞培养与接种
       a549 细胞系用含10%小牛血清的dmem 培养液培养,细胞长满单层后用0.25%胰蛋白酶消化,培养液吹打、离心，收集细胞用psb 稀释，浓度调至1×107 个细胞/ml，每只小鼠以0.2ml 接种于右腋皮下，待肿瘤长至体积约为1000mm3 时移植。
2.2 造模及分组
       选择生长良好、瘤结无破溃的荷瘤裸鼠，拉断颈椎处死，在净化工作台内，无菌条件下完整剥离瘤结，用生理盐水洗去血渍，剪开瘤结，清除中心坏死组织，充分匀浆制备瘤细胞悬液，加生理盐水稀释细胞数至1×107 个细胞/ml。取0.2ml/只，接种于裸鼠右腋窝皮下， 接种在30min 内完成。10 天后肿瘤体积约在100-300mm3 之间（32 只裸鼠造模全部成功）时，根据性别分层，按肿瘤体积大小随机分为模型对照、茶多酚、易瑞沙、茶多酚加易瑞沙4 组，每组8 只，称体重标号。
2.3 给药剂量与方法
      给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。①模型对照组，生理盐水每天0.2ml/10g 灌胃；②茶多酚干预组，茶多酚按112.5mg/kg/d（成人治疗量900mg/70kg/d 换算）给药，生理盐水配置浓度为5.625 mg/ml，每0.2ml/10g 灌胃；③易瑞沙干预组，易瑞沙按64mg/kg/d（成人治疗量500mg/70kg/d 换算）给药，生理盐水配制成浓度为3.2mg/ml，每天灌胃0.2ml/10g；④茶多酚加易瑞沙组，两药的给药剂量与单用药组相同，为保证灌胃体积的一致性，茶多酚配制浓度为11.25mg/ml，易瑞沙配制浓度为6.4mg/ml，每天各0.1ml/10g 灌胃。分组当天开始给药，每天一次，连续14 天。
2.4 计算方法
       药物处理前、后每4 天用毫米游标卡尺测量肿瘤长、宽Zui大垂直直径。按如下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=肿瘤长径×肿瘤短径2/2。用药结束后2 天处死裸鼠，取出肿瘤，称重。按如下公式计算肿瘤抑制率：抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×。
2.5 统计方法
       采用 spss13.0统计软件进行数据处理。干预治疗前后小鼠体重以及肿瘤体积以x ± s表示，并采用t 检验，组间比较采用f 检验，当p<0.05 时被认为有统计学意义；肿瘤抑制率以百分率表示。
3. 结果
3.1 一般性观察
       实验前各组裸鼠一般状况良好，实验结束时32 只裸鼠全部存活。动态观察发现，模型对照组裸鼠觅食、饮水正常，但活动减少，反应较迟钝；三个治疗组祼鼠觅食、饮水、活动等状况良好；易瑞沙组与联合用药组裸鼠有轻度腹泻，但未见消瘦、淤血等异常现象。
1.1 肿瘤体积变化
      从分组用药开始到实验结束，移植瘤体积变化见表1。

                                   表 1.实验各组肿瘤体积的动态变化( x ± s )
                                                 肿瘤体积mm3

时间                       肿瘤模型组                            茶多酚干预组      
第0 天                 161.71±26.38                      158.08±30.50  
第4 天                 388.89±57.86                      187.62±32.22﹡
第8 天                 766.10±186.29                    325.82±60.06﹡
第12 天                1258.77±321.32                  726.195±139.87﹡
第16 天                1793.68±483.06                   1239.13±248.84﹡▲

                            易瑞沙干预组                        茶多酚加易瑞沙组

                          164.26±32.09                       163.32±38.97
                          270.05±57.83﹡                    243.49±59.43﹡
                          382.04±76.51﹡                    354.89±86.67﹡
                          714.69±231.03﹡                  565.69±156.53﹡
                          1200.10±233.09﹡▲             866.15±268.15﹡
从表1 中可见，从第4 天开始，三个*体积与模型组相比，有统计学意义（p＜0.01）；联合用药组肿瘤体积增长较慢；实验结束时，联合用药组瘤体偏小，与单独用药组相比，有统计学意义（p＜0.05）。

3.2 肿瘤抑制率
       茶多酚与易瑞沙单独使用时抑瘤率分别为33.0%和34.2%，与模型组相比，有统计学意义(p＜0.01)；茶多酚与易瑞沙联合使用时抑瘤率达57.1%，与单独用药相比，有统计学意义(p＜0.05) （见表2）。
                       表 2.实验各组肿瘤重量及抑瘤率（ x ± s ）
   分组                   n                      瘤重g                        肿瘤抑制率(%)
肿瘤模型组                8                 1.58±0.46                        ——
茶多酚干预组              8                 1.06±0.34﹡▲                    33.0
易瑞沙干预组              8                 1.04±0.31﹡▲                    34.2
茶多酚加易瑞沙组         8                 0.68±0.25﹡                       57.1
与模型组比﹡p＜0.01；与联合用药组比▲p＜0.05
4. 讨论
非小细胞肺癌属常见高发恶性肿瘤，对放化疗敏感性较差，但其瘤体血管丰富，抑制其血管生成疗效显著，是目前研究的重点。我们的前期研究表明，茶多酚对移植性s180 及乳腺癌emt6 小鼠肿瘤均有明显抑制作用[6、7]；检测肿瘤组织mvd、timp-2、vegf 发现，茶多酚可以通过下调vegf、上调timp-2 的表达，抑制肿瘤微血管的生成，降低肿瘤微血管密度[8]。有研究表明[9]，易瑞沙的抗肿瘤效应是通过下调肿瘤细胞对vegf 及bfgf 的表达，影响内皮细胞的增殖，减少肿瘤细胞的血供来实现的。我们推测，茶多酚与易瑞沙可能在抑制肿瘤血管生成方面有协同作用。本实验结果表明，单独使用茶多酚、易瑞沙对人肺腺癌a549 移植瘤抑制作用明显，两者的抑瘤效果相近，两者联合使用时抑瘤效果明显增强。除了易瑞沙组与联合用药组裸鼠进食量偏少，有轻度腹泻外，三个治疗组未见其它不良反应。说明茶多酚、易瑞沙及两者联合治nsclc，不良反应较轻，抑瘤效果较好。特别是联合用药的抑瘤效果与单独用药相比
增效明显，为未来临床两药的联合使用，增强疗效奠定了一定的基础。
在下一步的研究工作中，我们将从抗血管生成的角度来探讨茶多酚、易瑞沙及两者联合用药对非小细胞肺癌的抑制作用。并以易瑞沙抗血管生成密切相关的信号转导通路作为研究重点，进一步阐明茶多酚抗肿瘤血管生成的分子机制，为茶多酚用于肿瘤临床提供理论依据。
参考文献
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3. fujimoto n , sueoka n , sueoka e , et al . lung cancer prevention with epigallocatechin gallate using
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4. 朱晔涵，徐春明，胡华成，等. 表没食子儿茶素没食子酸酯对人肺腺癌移植瘤模型作用的实验研究[j].
苏州大学学报(医学版), 2005: 25(6).
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7. 张燕明, 徐力, 陈信义. 茶多酚抗移植性乳腺癌作用的研究[j]. 国际中医中药杂志, 2006, 28(11): 354-356.
8. 徐力, 李冬云, 侯丽, 等. 茶多酚干预移植性s180小鼠肿瘤血管相关因子表达[j].中国肿瘤, 2006, 15(6), 363-365.
9. ciard